核酸电泳常用染色液
1、溴化乙锭(ethidium bromide, EB)
较为常用的核酸荧光染料,可嵌入核酸双链的配对碱基之间,在紫外线激发下,发出桔红色荧光。 EB-DNA复合物中的EB发出的荧光,比游离的凝胶中的EB发出的荧光强度大10倍,电泳槽,因此*洗净背景即可清楚观察核酸带型。若EB背景太深,可将凝胶 浸泡于1mmol/LMgSO4中1h或10mmol/L MgCI2中5min,电泳槽,使非结合的EB褪色,这 样可检查到10ng的DNA样品,EB也可用于检测单链DNA或RNA,但其对单链核酸的亲和力相对较小,荧光产率也相对较低。
2、吖啶橙(acridine orange, AO):
吖啶橙可嵌入双链核酸碱基对之间,转印电泳槽,在254nm紫外线激发下发出530nm的绿色荧光;还通过静电与单链核酸的磷酸基结合,在254nm紫外线激发 下产生640nm的红色荧光。因此可区分单链和双链核酸,灵敏度分别为0.1μg和0.05μg。但吖啶橙的染色操作要求严格,应在 22℃,0.01mol/L磷酸钠缓冲液(pH7.0)中避光浸泡30min,然后在搪瓷盘中用该缓冲剂4℃脱色过夜或22℃脱色1~2小时。
3、亚甲蓝(methylene blue)
可将RNA染成蓝色,但灵敏度不高,而且操作时间长。染色过程:胶浸泡于0.02%的亚甲蓝,10mmol/L Tris-Ac(pH8.3),4℃放置1~2h,用净水洗5~8h(反复换水),带型肉眼可见,较低检测量为 250ng。
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电泳槽内无电流(铂金电极上无气泡)
1、首先利用万用表检查电泳电源有无输出电压(注意选择直流电压挡,输出不得**过量程,以免损坏万用表)。
2、利用万用表电阻挡检查电泳槽导线是否导通。
3、利用万用表电阻挡检查电泳槽电极头与铂金丝之间是否导通,重点检查电极头是否与连接铂金丝的焊片紧密连接,如发现松动请使用尖嘴钳将其紧固即可,完毕后再进行检测,若还没有电流通过则检查铂金丝是否断裂,若铂金丝有断裂迹象则需要和生产厂家的售后服务部门联系,由厂家负责处理,一般需要对铂金丝进行更换处理。
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DNA电泳原理
生物大分子在一定pH条件下,通常带电荷,将其置于电场中,小型转印电泳槽,会以一定的速度向与其电荷性质相反的电极迁移,迁移速度称电泳速率。
电泳速率与电场强度、分子所带的净电荷数成正比,与分子与介质的摩擦系数成反比。 摩擦系数与分子的大小、构型及介质的粘度有关。
在生理条件下,DNA分子糖-磷酸骨架中的磷酸基团呈离子化状态,故DNA实际上呈多聚阴离子状态,在电场中向 正极方向迁移。
糖-磷酸骨架在结构上重复,故等量的双链DNA几乎带等量的净电荷。
如电场强度一定、电泳介质相同,电泳速率就取决于核酸分子的大小和构型。 构型相似的分子:分子量越大、迁移越慢。